Cytométrie en flux et tri cellulaire

Analyse et tri cellulaire

Coordonnées

Responsable scientifique de la plate-forme :  

Dr Thierry Idziorek
thierry.idziorek@inserm.fr
Tél 03 20 16 92 28

Responsables techniques : imprt.cytometrie@inserm.fr

Nathalie Jouy
Nathalie.jouy@inserm.fr

Emeline Machez
emeline.machez@univ-lille2.fr

Tél 03 20 16 92 16          

Situation :

Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille 1 place de Verdun 59045 Lille cedex
http://www.ircl.org

PRESENTATION

Localisée à l'IRCL, la plateforme de cytométrie en flux et de Tri cellulaire est une structure dédiée à l'analyse cellulaire. C’est un service commun de l’IMPRT- IFR-114, ouvert à l'ensemble des services de recherches fondamentales et appliquées, qu'ils soient académiques (Universités, CHRU, INSERM, CNRS) ou privés. La plate-forme est d’autre part labellisée IBiSA (Infrastructures en Biologie, Santé et Agronomie) au travers du BICeL  (Bio Imaging Center Lille Nord-de-France www.bicel.org).

La plateforme a plusieurs missions :

  • Suivre et soutenir les utilisateurs dans la préparation des échantillons, l'acquisition des données, ainsi que pour l'interpération des résultats.
  • Former en théorie et en pratique les futurs utilisateurs pour leur permettre d'être autonomes.
  • Garantir la reproductibilté des résultats et leur validité par une maintenance rigoureuse des appareils.
  • Assurer une veille technologique, et développer et mettre au point des techniques adpatées au matériel et aux besoins des utilisateurs.

MATERIELS DISPONIBLES

  • 1 trieur de cellules :
    ARI
    A III SORP (Becton-Dickinson, logiciel DIVA) : 5 lasers UV, 405nm 488nm, 561nm et 633nm permettant la mesure de 19 paramètres de fluorescence (filtres Bande-Passe disponibles : 450/50, 530/30, 525/50, 586/15, 610/20, 670/30, 695/40, , 710/50, 730/45, 780/60, 405/20, 488/10) et quatre voies de tri. Les échantilons à trier peuvent être maintenus de 4°C à 37°C et ceux triés de 4 à 37°C selon les besoins et de manière indépendante. Possibilité de tri sur des tubes Eppendorf.

 

  • Trois analyseurs :

LSR FORTESSA X20 (Becton-Dickinson, logiciel DIVA) : 5 lasers UV, 405nm 488nm, 561nm et 633nm permettant la mesure de 20 paramètres de fluorescence (filtres Bande-Passe disponibles : 525/30, 575/25, 620/20, 675/30)

 

Cell Lab Quanta-MPL (Beckman –Coulter, logiciel Quanta) : 1 lampe UV, 1 laser 488nm et mesure de 5 paramètres et le comptage absolu des particules (filtres Bande-Passe disponibles : 450/50, 530/30, 525/50, 586/15, 610/20, 670/30, 695/40, , 710/50, 730/45, 780/60, 405/20, 488/10)

 

 

 

 

Cyan ADP (Beckman –Coulter, logiciel Summit) : 3 lasers 405, 488 et 633 nm permettant l’analyse simultanée de 9  paramètres de fluorescence et la détection en haute vitesse d’événements rares (filtres Bande-Passe disponibles :

  • 1 poste de réanalyse avec les logiciels suivants:

    Cytobank, Summit v2.5, ModFit, Infinicyt, FACSDiva, Kaluza V1.8

  • Matériel annexe
    Le service possède une hotte ainsi qu’un incubateur qui pourront être momentanément utilisés pour conserver les cellules avant ou jusqu’à la fin du tri. Le service possède une centrifugeuse (4°C) et une station d'imagerie FLoid (Life technology) permettant de vérifier les noyaux ainsi que les fluorescences vertes et rouge. Pour la bonne conservation des cellules l’utilisateur devra ramener son propre matériel stérile (tampon, milieu, pipettes, flasque et plaque). Une machine à glace est disponible à proximité du service.

 

 

 

 

 

 

 

signaler un dysfonctionnement : imprt.cytometrie@inserm.fr

prendre un RDV avec le personnel : imprt.cytometrie@inserm.fr

PRINCIPE

La cytométrie est une technique performante et rapide pour détecter les différentes propriétés physiques et fonctionnelles d’une population cellulaire. Elle permet l’analyse en temps très court et sur une grande quantité de cellules, de plusieurs paramètres sur une même cellule de façon semi-quantitative : la taille de la particule, son contenu en granules intracellulaires, son contenu en ADN, la présence ou non de marqueurs spécifiques. Les cellules sont marquées par un plusieurs anticorps couplés à des fluorochromes ou par des molécules fluorescente spécifiques de certaines fonctions ; grâce à la présence d’au moins 5 lasers dont sont équipés les appareils de la nouvelle génération, il est possible d’utiliser une gamme de fluorochromes et de mesurer jusqu’à de 8 à 20 paramètres différents pour chaque cellule en simultané.

Le dispositif de tri de certains cytomètres permet une séparation physique des cellules selon les propriétés observées lors de l’analyse. La technique de tri est une étape intermédiaire et parfois indispensable dans certaines expériences comme l’homogénéisation d’une population vis-à-vis d’un critère soit pour une étude génomique ou protéique soit pour des tests pharmacologiques.

APPLICATIONS

  • Immunophénotypage multicouleur
  • Cycle cellulaire avec différents intercalants
  • Potentiel mitochondrial, apoptose, stress oxydatif
  • Microorganismes
  • Spermatozoïdes
  • Comptage absolu
  • Clonage
  • Détection, caractérisation et tri d’évènements rares tels que les cellules souches (test Aldefluor, exclusion du Hoechst, pyronine Y).

Développement et mises au point en cours

  • Test de nouvelles sondes de prolifération  et de cycle sur cellules vivantes
  • Test de nouveaux fluorochromes d’immunophénotypage
  • Tri des phénotypes aberrants dans les leucémies
  • FRET (CFP/YFP: filtres 529/28 et 466/38 disponibles), consulter la plateforme pour d'autres applications.
  • Transduction du signal

CONDITIONS D’ACCES

Les utilisateurs intéressés doivent prendre RDV pour un premier contact avec Nathalie JOUY et/ou Thierry IDZIOREK pour évaluer la faisabilité du projet.
Le formulaire inscription utilisateur et l’acceptation du règlement intérieur doivent être remplis et signer par les différents acteurs pour avoir le droit de venir sur la plateforme.

Formation :

Les utilisateurs doivent suivre une formation théorique et pratique pour pouvoir utiliser librement les analyseurs. Les formations théoriques se font en groupe régulièrement (au moins une / trimestre). Les formations pratiques se font par goupe de 3 personnes.

Réservation :

La réservation des appareils est en ligne sur le logiciel GRR sur le site https://adito.lille.inserm.fr (procédure de connexion). Si vous avez besoin d’aide pour vos acquisitions, veillez à vérifier la disponibilité du personnel.
Les identifiant et mot de passe pour se connecter au site de réservation sont à demander aux responsables techniques de la plateforme.

Des protocoles à disposition

Protocole de cycle cellulaire par iodure de propidium
Protocole d’immunophénotypage de surface
Protocole d’immunophénotypage intracellulaire
Procédure d’arrêt du Cellab quanta.pdf