Microscopie Electronique

Imagerie Cellulaire, Tissulaire et Moléculaire

Responsable scientifique : Cécile ALLET

Responsable technique : Anne LOYENS

Coordonnées

cecile.allet@inserm.fr
Tél. 03 20 29 88 88
INSERM UMR837 JPARC - Bâtiment Biserte - Rue Polonovski - 1, place de Verdun - 59045 Lille Cedex

Matériel disponible, application, prestation

La plateforme de Microscopie Electronique dispose d’un microscope électronique en transmission Zeiss 902, 80 KV (1988), muni d’une pompe turbomoléculaire permettant d’obtenir rapidement un bon vide dans la colonne. Bien qu’il puisse être utilisé pour effectuer des études en diffraction, il est presque totalement employé en mode image. Son grossissement maximum est de 400 000 avec un pouvoir séparateur théorique de 0,4 nanomètres. A titre indicatif, cela signifie qu’une hématie aurait un diamètre d’environ 3 mètres. Il faut cependant savoir qu’en biologie la plupart des observations s’effectue à des grossissements directs compris entre 3 000 et 30 000. Ce microscope électronique est doté d’une caméra numérique Orius 832 SC1000 (2006) couplé à un logiciel de prise et de traitement d’images Gatan Digital Micrograph, qui permet d’obtenir très rapidement des photographies de très bonne qualité (11 Mpixels).

Un ultramicrotome Leica Ultracut E (1986) permet de faire des coupes semi-fines de 0,5 à 2 µm et des coupes ultrafines de 60 à 90 nanomètres d’épaisseur dans des blocs d’échantillons inclus dans des résines.

Ce matériel permet d’étudier l’ultrastructure d’une particule, d’une cellule et des organites cellulaires, de donner une idée du rôle de certains organites ou de la santé d’une cellule ou d’un tissu après un traitement. Les principales applications de la plateforme sont des études sur tissus de patients ou d’animaux servant de modèles pour déceler l’existence d’une plasticité morphologique (exemple : plasticité ultrastructurale du tissu nerveux de rongeurs dans l’hypothalamus au cours du cycle de reproduction) ou pour une pathologie donnée (exemple : dégénérescence neurofibrillaire au cours de la maladie d’Alzheimer).

La préparation des échantillons dépend de leur nature. Dans tous les cas l’échantillon est traité avec des sels de métaux lourds (tungstène, uranium ou plomb) afin d’obtenir un contraste suffisant pour être visible sous le faisceau d’électrons.

  • Sur échantillons dispersés
    (virus, nanoparticules, lipoprotéines sécrétées,…) : coloration négative à l’acétate d’uranyle ou l’acide phosphotungstique sur grilles de nickel carbonées.

   

  • Sur Culture cellulaire :
    les cellules en suspension
    (spermatozoïdes,…) ou les extractions cellulaires (mitochondries,…) sont fixées, déshydratées par des étapes de centrifugation et incluses en résine en tubes eppendorf ou en moules à inclusion.
   
  • Sur Culture cellulaire :
    les lignées ou culture primaire de cellules adhérentes
    sont cultivées sur plaques de culture ou sur filtres poreux, puis fixées, déshydratées et incluses en résine, soit en tubes eppendorf soit dans des moules à inclusion plats.
   
  • Sur tissus :
    les morceaux de tissus (1 mm3) ou tranches vibratomes sont fixés, déshydratés et inclus en résine dans des moules à inclusion plats.
 

 

Pour les études de morphologie, la fixation de l’échantillon se fait par un mélange de paraformaldéhyde (1 à 2%) et de glutaraldéhyde (1 à 2%), suivie d’une post-fixation au tétroxyde d’osmium (1%) ; une déshydratation en bains d’éthanol de concentration croissante permet l’inclusion dans des résines Epoxy hydrophobes (Araldite ou Epon).

L’utilisation de méthodes immunocytochimiques diverses (avant inclusion avec enzymes ou or colloïdal, après inclusion avec or colloïdal de 5 à 20 nm ou combinaison des deux types d’approche) permet de mettre en évidence des protéines au sein des tissus ou des cellules. La plateforme a une excellente maîtrise de ces méthodologies puisqu’elle a été à l’origine de la mise au point de certaines d’entre elles : co-localisations de protéines dans des granules neurosécrétoires ou d’interrelations entre cellules ou organites. Cette technique nécessite néanmoins des mises au point pour permettre une combinaison entre bonne préservation ultrastructurale et bonne immunoréactivité, ce qui conditionne la composition du fixateur (quantité de glutaraldéhyde) ou le choix de la résine d’inclusion (résine acrylique LRWhite).

Publications

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Ciofi P, Garret M, Lapirot O, Lafon P, Loyens A, Prevot V, Levine JE (2009) Brain-endocrine interactions: a microvascular route in the mediobasal hypothalamus. Endocrinology 150:5509-5519.

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Sultan A, Nesslany F, Violet M, Begard S, Loyens A, Talahari S, Mansuroglu Z, Marzin D, Sergeant N, Humez S, Colin M, Bonnefoy E, Buee L, Galas MC (2011) Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem 286:4566-4575.

Vingtdeux V, Hamdane M, Begard S, Loyens A, Delacourte A, Beauvillain JC, Buee L, Marambaud P, Sergeant N (2007a) Intracellular pH regulates amyloid precursor protein intracellular domain accumulation. Neurobiol Dis 25:686-696.

Vingtdeux V, Hamdane M, Loyens A, Gele P, Drobeck H, Begard S, Galas MC, Delacourte A, Beauvillain JC, Buee L, Sergeant N (2007b) Alkalizing drugs induce accumulation of amyloid precursor protein by-products in luminal vesicles of multivesicular bodies. J Biol Chem 282:18197-18205.